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窖泥中产酸功能菌筛选及发酵条件初探

作者:酿酒杂志 来源:中国酿酒网 日期:2018-01-11
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 王耀1,李1 ,甘广东1,姜雷1 ,杨勇1 ,沈晓波1,刘志刚2 ,房晓辉2

1.江苏洋河酒厂股份有限公司,江苏宿迁223800;2.江南大学生物工程学院,江苏,无锡214000

摘要:从洋河酒厂优质老窖泥中分离纯化筛选出一株产己酸的芽孢杆菌YHY03,经生理生化分析初步鉴定为克氏梭状芽孢杆菌。通过正交优化获得最优发酵培养基,并对YHY03发酵产酸代谢过程进行研究。实验结果表明:其发酵改良培养基的物质最优配比为:1.5%蔗糖;2%乙醇;0.5%乙酸钠,0.1%酵母膏、0.04%磷酸氢二钾、0.05%硫酸铵、0.02%硫酸镁。优化后己酸产量为285.32mg/100mL,己酸产量提高比例为148.2%,优化效果较明显。该菌株代谢产生己酸主要通过两个途径:0 4天直接利用乙酸合成,同时积累丁酸;6 12天利用丁酸反应形成己酸。

关键词:己酸;窖泥;纯化;正交优化

中图分类号:TS262.3TS261.13;TS261.15;TS261.4 文献标识码:B

 

0 引言

己酸菌是一类能发酵产生己酸的厌氧芽孢细

菌,是浓香型白酒生产中最重要的窖泥功能菌,其

代谢产物己酸,是浓香型白酒的主体酸之一[1]。己酸

在白酒中起到呈香、助香、减少酒体刺激以及缓冲

平衡的作用[2],并且己酸是浓香型白酒主体香气成

分己酸乙酯的前体。生产上,通过扩大培养生产以

己酸菌为主的窖泥功能菌液,用于人工窖泥生产以

及窖池保养,改善窖池生态环境,提高基酒质量。也

有通过发酵培养己酸菌,产生以己酸为主体的风味

有机酸,作为调味酸,改善浓香型白酒的风味及口

感。老窖泥由于长期生产,富集筛选了丰富的包括己

酸菌在内的有益酿酒微生物。本实验从优质老窖泥

中分离、纯化出一株高产己酸的功能细菌,并对其发

酵条件进行优化,并分析产酸代谢情况,以期为改善

窖内微生态环境、提高浓香型白酒质量提供参考。

 

1 材料与方法

1.1 实验材料

窖泥样品:取自江苏洋河酒厂股份有限公司老

窖池窖泥

实验药品:酵母膏,乙酸钠,蛋白胨,葡萄糖,碳

酸钙,无水酒精,生物素,对氨基苯甲酸,硫酸镁,磷

酸二氢钾

实验设备:旋转蒸发器,恒温培养箱,离心机,

分光光度计,气相色谱仪,厌氧培养箱

1.2 实验方法

1.2.1 实验流程[3,4]

窖泥取样→预处理→富集培养→己酸定性分

→平板分离纯化→发酵代谢产物分析→生理生

化分析→单因素实验→正交试验→验证实验→发

酵过程分析

1.2.2 窖泥预处理[5]

灭菌后的20 支装有每支15~20mL 富集培养基

的试管里分别加入1g窖泥,玻璃棒捣碎搅匀,85

水浴锅加热10min

1.2.3 己酸定性分析CuSO4显色法定性分析

取培养后样品上层清液2mL,加2%硫酸铜溶

2mL,乙醚1mL,振荡,使之反应分层。观察乙醚

层呈现的绿色并记录,颜色越深,则己酸含量越高。

1.2.4 发酵代谢产物—气相色谱分析[6]

取上清液浓硫酸调节pH2~3,过0.42μm

膜,直接进样色谱分析。GC 条件:柱子型号是

CP-WAX 57CB(规格50m 长,内径0.25mm,膜厚

0.2mm);初温35℃,保持6min,再以4/min 升温至

75℃,保持10min,再以25/min 升温至175℃,保

2min,最后以10/min 升温至215℃,保持

24min。分流比为351,进样量为1μL,载气为N2

内标共3 个,分别是叔戊醇、乙酸正戊酯和2-

基正丁醇。

1.2.5 菌种的初步鉴定[7]

①革兰氏染色:从斜面上挑取少许菌苔,涂布

在干净玻片上的无菌水中,风干固定,初染、媒染与

复染,镜检。

②糖类发酵:乙酸钠0.5%、酵母膏0.1%、磷酸

氢二钾0.04%、硫酸铵0.05%、硫酸镁0.02%,分别

添加1%葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉,pH6.8~7.210%

接种、34℃发酵,观察发酵状态,分析代谢产物。

③明胶水解:蛋白胨0.5%、明胶15%pH7.0

大试管,20℃培养,观察表面有无凹陷现象。

④甲基红试验、V.P 试验、硝酸盐还原试验、产

硫化氢试验、接触酶实验:参照常见细菌鉴定手册。

1.2.6 正交优化实验

通过单因素实验确定因素水平,采用L9 34)正

交设计表进行实验设计,运用Minitab 软件对所得

结果进行结果分析,得出最优水平组合。

1.2.7 发酵罐培养

采用优化后培养基,10%接种量,37℃培养,每

2天取样进行镜检及代谢产物分析。

2 结果分析

2.1 己酸菌分离纯化结果分析

取富集培养后发酵液进行CuSO4 显色定性分

析,挑选出颜色深的发酵样品。经多次平板分离纯

化,分离出6株菌。分别以6 株菌株作为菌种进行发

酵,对发酵液进行色谱分析,所得结果如表1 所示。

由表1 可知,12345 号菌株己酸产量低,不

作为目标菌株。6 YHY03 菌发酵后己酸产量较

高,达到104.95mg/100mL,表明该菌株代谢产生己

酸能力强,作为目标菌株。

 

2.2 生理生化特性分析

对菌株YHY03 进行生理生化特性分析,所得

结果如表2 所示。

菌株YHY03 菌落形态及镜检形态如图1 2

所示。

依据菌株形态、代谢产物分析及生理生化特性

分析结果,对照“伯杰氏细菌鉴定手册”,初步鉴定

菌株YHY03 为克氏梭状芽孢杆菌。

2.3 发酵条件优化

2.3.1 不同糖类物质对己酸产量的影响

在巴氏培养基基础上,分别添加不同糖类进行

发酵培养,气相色谱分析代谢产物结果如表3 所示。

在巴氏培养基基础上增加糖类,能够为菌株提

供一定额外的碳源,对代谢方向可能有一定的影

响。由图3可知,当培养基加入葡萄糖为底物时,发

酵呈现明显抑制菌体代谢产己酸,代谢朝生成乙酸

方向;而培养基加入蔗糖、乳糖、淀粉均能提高己酸

产量,尤其以培养基中添加蔗糖具有最大的己酸产

量,达到151.03mg/100mL,推测蔗糖对于菌体代谢

产生己酸具有最强促进作用。

2.3.2 单因素实验结果

2.3.2.1 蔗糖添加量为变量的培养基对己酸产量的

影响

对添加不同蔗糖量的培养基发酵后产物进行气

相色谱分析,所得结果如图4 所示。

由图4 可知,己酸产量随着蔗糖添加量的增加

呈上升状态,当蔗糖添加量达到2%后继续添加则

己酸产量又呈下降趋势,整体呈现出先增后减的态

势。添加2%的蔗糖时,己酸产量达到峰值

195.03mg/100mL

2.3.2.2 乙醇添加量为变量的培养基对己酸产量的

影响

对不同乙醇添加量的培养基发酵后产物进行

气相色谱分析,所得结果如图5 所示。

由图5 可知,己酸产量随着培养基中乙醇添加

量的增加呈上升状态,当乙醇添加量达到2%后继

续添加则己酸产量又呈下降趋势,整体呈现出先增

后减的态势。当培养基中添加2%的乙醇时,己酸产

量达到峰值259.09mg/100mL,随后随添加量增加己

酸产量逐渐降低。

2.3.2.3 乙酸钠添加量为变量的培养基对己酸产量

的影响对添加不同乙酸钠的培养基发酵后产物进行气

相色谱分析,所得结果如图6 所示。

由图6 可知,己酸产量随着培养基中乙酸钠添

加量的增加呈下降趋势。在所选的几个梯度中,当

培养基中添加0.5%的乙酸钠时达到最大的己酸产

量。

2.3.3 正交优化结果

依据优化培养基目的是为了使代谢偏向高产

己酸,因此以己酸产量作为培养基优化的依据。通

过单因素实验分别确定了单因素条件下蔗糖、乙醇

以及乙酸钠的最优条件所在水平区间,分别选取三

个水平。以蔗糖、乙醇以及乙酸钠作为因素,己酸产

量为优化依据,按照L934)设计表进行优化,考察不

同培养基组分对代谢产己酸的影响。各因素水平表

见表3

依照正交设计表进行实验,对实验结果进行正

交分析,所得结果如表4、图7 所示。

对上述正交实验结果分析得,极差R

RA>RC>RB,分析得各因素对YHY03 代谢产生己

酸的影响程度由大到小依次为:蔗糖> 乙酸钠>

醇。结合主效应图分析得,最佳水平为A1B3C2,即

发酵改良培养基的物质最优配比为:1.5%蔗糖;2%

乙醇;0.5%乙酸钠。

对上述最优配比结果进行验证实验,所得己酸

产量为285.32mg/100mL,对比正交实验结果具备最

大的产酸量,故正交实验结果验证成功,正交实验

所得结果为最优方案。因此,YHY03 代谢产生己酸

的最优培养基组成为:1.5%蔗糖;2%乙醇;0.5%

酸钠、0.1%酵母膏、0.04%磷酸氢二钾、0.05%硫酸

铵、0.02%硫酸镁。

2.4 发酵代谢动态变化过程

2.4.1 生长曲线测定

5L 发酵罐为发酵容器,采用改良后的培养

基,10%接种量进行小罐培养实验,每两天对发酵过

程进行取样分析,所得结果如表5 所示。

由表5 和图8 可知,YHY03J)发酵过程中总菌

数呈现典型的S 型生长曲线。发酵过程中菌体数目

呈现先增长后下降趋势,第4 6 天增长速率最

高,推测为分裂期。第8 天出现最高菌数,达到

9.3×107/mL,随着发酵时间延长,总菌数下降,芽

孢增多,推测后期由于代谢产物产物积累抑制菌体

代谢,菌体开始逐步走向衰亡期,数目下降。发酵过

程中pH 逐渐降低,前期快速下降,后期由于CaCO3

的缓冲作用,使得pH稳定在6.2 左右。

2.4.2 产酸代谢分析

在发酵过程中,进行取样,对样品进行酸化处

理并过滤,直接进样进行色谱分析。气相色谱分析

结果如图所示。

由图9 可知,发酵过程中乙醇含量逐渐被消

耗,6 天前乙醇消耗速率较低,6 天后乙醇消耗速率

提高。依据物质含量变化,可将代谢过程分为三个

时期。0 2天,主要代谢产生乙酸,乙酸含量增加

明显。2 4 天,主要为乙酸代谢生成丁酸和己酸,

乙酸含量迅速降低,而己酸和丁酸含量迅速增加,

并且增长速率接近,说明此阶段直接利用乙酸合成

丁酸和己酸。4 12 天,主要为丁酸代谢产生己酸,

乙醇消耗速率提高,直至丁酸被消耗,己酸含量稳

定。由图可知,该菌株代谢产生己酸主要通过两个

途径:直接利用乙酸合成;先合成丁酸再利用丁酸

反应形成己酸。随着发酵时间延长,己酸略有下降,

丁酸和乙酸略有回升,最终发酵后期达到动态平

衡。

3 结论

3.1 本实验从老窖泥中筛选出一株高产己酸菌株

YHY03,初步鉴定菌株为克氏梭状芽孢杆菌。该菌

株产己酸能力强,发酵过程中具有典型的生长曲

线。

3.2 本实验以巴氏培养基为基础,以己酸产量为依

据,通过L934)正交优化表优化,最终确定YHY03

发酵改良培养基的物质最优配比为:1.5%蔗糖;2%

乙醇;0.5%乙酸钠、0.1%酵母膏、0.04%磷酸氢二钾、

0.05%硫酸铵、0.02%硫酸镁。优化后己酸产量为

285.32mg/100mL,较最初的传统巴氏培养基己酸产

量提高了170.37mg/100mL,提高比例为148.2%,优

化效果较明显。

3.3 通过发酵代谢动态变化过程分析可知YHY03

菌株在0 6 天主要完成菌体分裂以及己酸代谢

前提物质积累,己酸生成主要通过乙酸直接合成途

径。6天后开始利用丁酸大量合成己酸,发酵10

己酸含量达到最高。

[参考文献]

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